Trial#130.1: Verifica della capacità di colonizzazione del tratto gastrointestinale in soggetti sani, in seguito all’utilizzo del lievito lattico Kluyveromyces marxianus fragilis B0399, mediante l’esame delle feci.

 

Il Kluyveromyces marxianus fragilis B0399 è un lievito probiotico usato come integratore dietetico. Il presente studio si è proposto di valutare la colonizzazione del tratto gastrointestinale in seguito all’utilizzo del Kluyveromyces marxianus fragilis B0399 .

Il prodotto è stato somministrato a 17 volontari sani per un periodo di 14 giorni. Le feci dei soggetti sono state analizzate per valutare la presenza del Kluyveromyces marxianus fragilis B0399, al tempo T0, prima dell’’inizio dell’assunzione del prodotto (verifica assenza) e alla fine, dopo 14 giorni (tempo T14).

 

L'assunzione da parte di soggetti sani di Kluyveromyces fragilis marxianus B0399 al dosaggio di 20 milioni CFU/die per due settimane risulta pienamente sufficiente ai fini della colonizzazione intestinale, in assenza di effetti collaterali.

L’elevata entità della colonizzazione riscontrata dimostra con evidenza la capacita’ di resistenza alla barriera gastrica e fa ipotizzare che il Kluyveromyces fragilis marxianus B0399  possa essere efficacemente assunto anche a dosaggi sensibilmente più bassi di quelli esaminati (ad esempio 5- 10 milioni CFU/gg)

Al contrario osservato alcune prove ufficiali in campo animale si ritiene dubbio o addirittura inopportuno aumentare eccessivamente i dosaggi giornalieri.

 

 

 

 

 

La flora batterica intestinale ha un ruolo centrale sia nella nutrizione che nel mantenimento della salute e, nella sua complessità e funzione, gioca un ruolo unico nel nostro organismo

Diverse migliaia di differenti specie batteriche si trovano nell' intestino umano, alcune giudicate benefiche ( es bifidobatteri, lattobacilli, lieviti lattici) altre benigne ( es specie metanogene e saccarolitiche di clostridi e bacteroidi) in grado di contrastare l' eccessiva moltiplicazione di specie dannose per la salute umana ( specie proteolitiche di Bacteroidi, Clostridium difficile, C.perfrigens e le specie patogene di Enterobatteri).

I probiotici sono ceppi di microrganismi vivi con effetto benefico mediato dall' influenza sulla flora microbica intestinale.

I probiotici sono microrganismi in grado di superare la barriera gastrica e favorire la modulazione dalla flora batterica intestinale capaci di sopravvivere e mantenersi viabili per lunghi periodi di conservazione ed essere innocui per l'uomo.

Introducendo cibi con aggiunta di probiotici, i batteri utili che sopravvivono al transito attraverso il tratto gastroenterico ed arrivano nel colon, lo colonizzano alterando in modo favorevole l'equilibrio microbico.

I probiotici si sono rivelati utili nel trattamento di alcune affezioni intestinali come la diarrea dell' infanzia, la diarrea dei viaggiatori ed in certe malattie infiammatorie croniche dell' intestino.

L’obiettivo di questo studio è stato quello di verificare e valutare la capacità di superamento della barriera gastrica e di colonizzazione del tratto gastrointestinale in seguito all’utilizzo del Kluyveromyces marxianus fragilis B0399 ai normali dosaggi consigliati dalla casa distributrice.

 

 

Il Kluyveromyces marxianus fragilis B0399 è un lievito lattico con caratteristiche diverse dai lattobacilli e dai bifidobatteri e dal lievito Saccharomyces. Viene usato da tempo come probiotico anche in campo zootecnico (Commission Regulation EC 773/06). E’ una cellula di tipo eucariotico (Lachance M.A ¹) dotata di una elevata attività enzimatica lattasica (β-galattosidasi). Pertanto fermenta il lattosio con produzione di acido lattico. L’attività enzimatica, in condizioni anaerobiche, tipiche dell’intestino, è di tipo omofermentante, in quanto trasforma tutto il glucosio risultante in acido lattico, senza produzione di gas (CO2) (es Saccharomyces) (Vananuvat-Kinsella² ,Wasserman-Hopkins-Porges³). Cio’ contribuisce a modulare l’ambiente intestinale riducendone il pH. Risulta inoltre particolarmente resistente all’azione degli antibiotici (Voughan ⁴ )

 

Il Kluyveromyces marxianus fragilis B03999 sembrerebbe in grado di resistere allo shock gastrico. Tale capacità è stata testata anche in vitro (Susmel and Stefanon⁵ ) mediante la misurazione della capacità fermentativa prima e dopo digestione gastrointestinale. La resistenza alla digestione è risultata elevata.

La capacità di superamento della barriera gastrica è stata accertata anche con prove in vivo su animali monogastrici come i maialetti (che hanno un'apparato digerente molto simile a qulello umano (Lovrovich P. ⁶ ) e cavalli, testando la presenza di Kluyveromyces B0399 nelle feci e la modifica del pH nel colon ( Lowell R. S. ⁷. Susmel-Stefanon  ⁸,Bosi P. ⁹.)

 

 L’utilita’ del Kluyveromyces B0399  sembrerebbe provata da vari studi anche nei casi di disturbi del colon   (Andreoli S.¹⁰, Irvine EJ ¹¹ Bottona-Parisi-Zilli ¹²)

 

Come riferito dalla casa produtrice (i laboratori Turval srl di udine) Il ceppo utilizzato è il Kluyveromyces fragiilis marxianus B0399, depositato presso BCCM-Belgium Coordinated Collections of Microrganism, Culture Collection Mycoteque de l’Université Catholique de Lovain (Belgium) con sigla B0399, (Allegati A, A2)

 

La sperimentazione è stata impostata sulle linee guida di un progetto con i medesimi propositi “Colonization and Immunomodulation by Lactobacillus reuteri ATCC 55730 in the Human Gastrointestinal Tract” (Valeur ¹³ ).

 

3.3.4 - Prodotto oggetto dello studio e dosaggio

 

Sono state utilizzate confezioni in commercio di prodotti in capsule già notificate al ministero della Salute e normalmente in commercio presso le farmacie : il Biosympa..

Come certificato dall’azienda produttrice Laboratori Turval Italia s.r.l. il prodotto Biosympa viene prodotto con 40 milioni (40*10⁶ ) ufc/g (Allegati A, A1, A2).

 

Il prodotto “Biosympa”,contenente il principio attivo Kluyveromyces marxianus fragilis B0399, è stato somministrato alla dose di una capsula al giorno (20*10⁶ cfu per caps.), per una dose giornaliera totale di 20*10⁶ UFC di Kluyveromyces B0399, per 14 giorni.

 

Sono stati arruolati 17 soggetti volontari sani, di età superiore a 18 anni (mediana 53, con età compresa tra 35 e 72 anni), 3 di sesso maschile e 14 femminile.

La valutazione dello stato di salute è stata fatta mediante colloquio medico per la raccolta e di tutti i dati anamnestici ritenuti necessari. In particolare veniva richiesto quali medicinali fossero stati assunti nei sei mesi antecedenti la sperimentazione, eventuali patologie manifestate di recente, la presenza di eventuali sintomi e la tipologia della dieta abituale. 

 

Sono stati esclusi i soggetti che nei tre mesi antecedenti la sperimentazione avessero assunto antibiotici o probiotici, presenza di severa malattia cronica e/o altra affezione del colon che comporti fragilità della mucosa, celiachia, occlusione e sub-occlusione intestinale, precedenti interventi chirurgici addominale con l’eccezione di ernia o appendicectomia, assunzione di medicamenti antipsicotici nei 3 mesi precedenti o di steroidi nel mese precedente, intolleranza al lattosio o immunodeficienza, scarsa compliance.

 

Durante il periodo del trattamento non era consentita, salvo uscita di studio, l’assunzione di farmaci che potessero alterare la funzione motoria o l’ assorbimento intestinale, inclusi lassativi ed antidiarroici, prodotti in grado di alterare la flora batterica intestinale (antibiotici e preparati commerciali contenenti probiotici).

 

Le feci delle persone coinvolte sono state analizzate per la verifica della presenza del Kluyveromyces marxianus fragilis B0399.

 

Prima dell’inizio del trattamento con Kluyveromyces marxianus fragilis B0399 sono stati raccolti i campioni al tempo T0 (T con zero) al fine di determinare lo stato iniziale della composizione fecale.

 

Per determinarne l’evoluzione nel tempo e l’influenza del trattamento con Kluyveromyces marxianus fragilis B0399 l’analisi dei campioni fecali è stata ripetuta dopo 14 giorni di somministrazione (tempo T14).

 

La prova qui descritta e’ stata condotta seguendo la traccia di criteri riconosciuti a livello europeo (Valeur ¹³ , EFSA ^{14 ,} , Francis C. Y ¹⁵)

Al fine di considerare la presenza del Kluyveromyces marxianus fragilis B0399 nel campione fecale , in mancanza di dati relativi lieviti lattici, si è considerato significativo un incremento di valore della conta nelle feci superiore a 10³ ufc/g in accordo con il valore assunto nello studio di riferimento riferito ai lactobacillus reuteri (Valeur ¹³)

 

Il materiale fecale è stato raccolto dai singoli soggetti mediante appositi contenitori sterili ( BIO-BOX raccoglitore per ricevere il campione di feci, for.me.sa.) e consegnati al medico responsabile. Tutti i contenitori con materiale fecale sono stati accuratamente conservati in frigorifero a temperatura costante 4°C.

 

 

Tutti i campioni originali sono stati preparati al fine di ottenere del materiale il più omogeneo possibile per eseguire l’analisi e la conta dei lieviti in modo quantitativo. 

Il laboratorio ha preparato la sospensione a titolo noto a partire dal campione solido iniziale.

La diluizione del materiale fecale è stata fatta con soluzione fisiologica sterile.

Le date di raccolta e arrivo dei campioni sono indicate in Tab 1

 

 

 

Le principali caratteristiche dei soggetti in studio e le date dei prelievi sono indicate in Tab 2.

 

Conta dei lieviti totali ad eliminazione interferenze da candida.

1)            Presenza e quantificazione dei microrganismi (lieviti) positivi al Sabouraud agar.

2)        Per eliminare le interferenze da candida e’ stato condotto uno screening delle colonie (di lievito) positive al Sabouraud agar mediante l’identificazione delle colonie di Candida (Medium Chromoalbicans agar) e mediante il loro esame al microscopico (contrasto di fase 12,5 x 40)

 

 

Conta dei lieviti totali, eliminazione interferenze da candida e accertamento della presenza di lieviti lattici (Kluyveromyces) ,

1)            Presenza e quantificazione dei microrganismi (lieviti) positivi al Sabouraud agar.

2)        Per eliminare le interferenze da candida , ‘ e ‘stato condotto, come sopra, uno screening delle colonie (di lievito) positive al Sabouraud agar mediante l’identificazione delle colonie di Candida (Medium Chromoalbicans agar) e ed e’ stato effettuato su tutte le piastre l’esame al microscopico (contrasto di fase 12,5 x 40).

3)            L’identificazione del Kluyveromyces : e’ stata utilizzata la metodica (fornita dai Laboratori Turval) riportata nel dossier approvato dalla EU ( regolamento 377/2006 ) per identificazione dei lieviti lattici (Kluyveromyces mediante semina su Medium MV1 Agar specifico per i lieviti lattici. (Lab CATAS CCIAA UD all. C)

4)        E’ stata effettuata l’osservazione al microscopio (a contrasto di fase 12,5 x 40) (dr. Valles ) allegato D.

 

 

Per quanto attiene la valutazione della presenza dei lieviti nelle feci, essa è stata definita nel modo seguente (Tab 3):

 

Le conte (CFU) si riferiscono al peso delle feci tal quale (t.q.)

 

La differenza tra frequenze (positività/negatività per il livello soglia prescelto tra T0 e T14) è stata analizzata con il chi-square test. L’analisi delle differenze quantitative tra T0 e T14

è stata valutata con il “Two-Sample T-test” ad una coda(Alpha=0.05). Le analisi sono state eseguite con il software NCSS 2007 software (NCSS Statistical software, Kaysville, Utah, USA).

 

Sono valutabili i risultati in 16/17 soggetti arruolati (94.12 %)

 

 Al tempo T/0, considerando i risultati ottenuti dalla conta totale dei lieviti e sottraendo a questi la conta delle colonie di Candida Albicans, la presenza di lieviti totali risulta essere trascurabile o assente per 13 su 17 campioni (76,47 %). I rimanenti 4 riportano una minima presenza di colonie (Tab 3).

 

Al Tempo T14 16/16 campioni (100 %) risultano positivi in termini di presenza di Lieviti, con un incremento statisticamente significativo (chi-square Test: X=19,2, p < 0,00001) rispetto a T0.

Analogamente, la valutazione quantitativa tra T0 e T14 evidenzia una differenza statisticamente significativa in termini di presenza di colonie (valori medi 1373,33 versus 460873,30 (p = 0,035).

L’incremento medio è stato di circa 3 logaritmi (range da 1 a 6). L’aumento appare maggiore nei casi in cui al Tempo T0 non vi era traccia di lieviti rispetto a quelli in cui essi erano rilevabili in quantità trascurabile o assai modesta (Tab 3)

Al tempo T/14 I lieviti o microrganismi positivi al Sabouraud-agar mediante la prova d’indentificazione eseguita su MV1- agar su 7 campioni scelti casualmente (3, 7, 9, 10, 12, 13, 19) sono risultati essere tutti Lieviti a fermentazione lattica (kluyveromyces marxianus/fragilis). (Tab 3).

Dall’esame comparativo microbiologico eseguito al microscopio su tutti i campioni Sabouraud-agar positivi risulta che le colonie isolate possono identificarsi nel 100% dei casi esclusivamente con un lievito lattico (kluyveromyces marxianus fragilis).

 

 

Campione N	T/0	T/14	T/14
	Lieviti totali (esclusi Candida) Ufc/g	Kluyveromyces marxianus fragilis B0399 Ufc/g	Attività lattasica
1	2x103	7x104	Positiva**
2	assenti	5x104	Positiva**
3	Trascurabile	5,7x104	Positiva*
4	4x103	7 x 104	Positiva**
5	Trascurabile	2,5 x 104	Positiva**
6	Trascurabile	2,5 x 104	Positiva**
7	Assenti	1,8 x 105	Positiva *
8	6,5x103	3 x 104	Positiva**
9	7x103	Non determinabile*	Positiva*
10	Trascurabile	3,2 x 105	Positiva*
11	Trascurabile	2,5 x 104	Positiva**
12	Trascurabile	4,4 x 103	Positiva*
13	Trascurabile	1,7 x 103	Positiva*
14	Trascurabile	2,5 x 104	Positiva**
15	Trascurabile	3 x 104	Positiva**
18	Trascurabile	Camp. non pervenuto
19	Assente	1,5x105	Positiva*

 

 

·        Trascurabile: (< 100 UFC/g)

·        Positiva*:(lievito lattico mediante identificazione su MV1 agar –medium selettivo per Kluiveromyces sp.)

·        Positiva**: (Lievito lattico mediante identificazione al microscopio)

·        Non determinabile*: (presenza di patina)

·        Nota : le conte (UFC) si riferiscono al peso delle feci tal quale (t.q.)

 

Nessuno dei soggetti trattati ha lamentato alcun tipo di effetti secondari.

 

In questo studio si dimostra che la presenza di Lieviti (diversi dalla candida) nelle feci dei soggetti sani è riscontrabile in meno del 25% dei casi. E’ ragionevole pensare che questi siano comunque lieviti diversi da Kluyveromyces fragilis marxianus B0399 (quli ad esempioi lieviti presenti in alimenti, tipo Saccaromices cervisiae e altri analoghi) in quanto nessuno dei soggetti in studio aveva assunto nei tre mesi precedenti prodotti contenenti tale principio attivo .

In ogni modo la somministrazione di Kluyveromyces fragilis marxianusB0399 al dosaggio prescelto di 20 milioni/die per via orale per due settimane è in grado di far riscontrare livelli molto elevati di Lieviti nel 100% dei casi trattati e le ulteriori analisi confirmatorie hanno dimostrato trattarsi di Lievito lattico Kluyveromyces fragilis marxianus B0399.

Nel nostro studio abbiamo scelto il valore soglia di positività a T14 in base alla letteratura di riferimento (Valeur ¹³). Tale valore però era riferito a Lattobacilli (lacttobacilus reuteri) , solitamente saprofiti dell’intestino umano. Il Lievito lattico Kluyveromyces fragilis marxianus , come peraltro confermato nel presente studio, è raramente presente in quantità apprezzabili, per cui potrebbe essere ragionevole assumere anche una soglia di positività minore, dell’ordine di 2 logaritmi.

Al di la di queste considerazioni, l’incremento quantitativo di prin cipio attivo riscontrato nelle feci è considerevole, varia infatti da tre a cinque logaritmi.

 

Del pari, l’entità del risultato è tale da far considerare un tempo alla colonizzazione desiderata inferiore a 14 gg, e anche l’ipotesi di dosaggi più ridotti, come visto in sistemi animali monogastrici come i maialetti a 35 kg , per i quali, secondo la commissione europea, sono sufficienti 4,56 milioni CFU/die (Valles-Lugano¹⁶ , Commission Regulation (EC) ¹⁷, Bottona-Parisi-Zilli ¹² )

Appare altrettanto importante constatare la trascurabile interferenza da parte della barriera gastrica che emerge dai risultati.

 

 

 

 

L'assunzione da parte di soggetti sani di Kluyveromyces fragilis marxianus B0399 al dosaggio di 20 milioni CFU/die per due settimane risulta pienamente sufficiente ai fini della colonizzazione intestinale, in assenza di effetti collaterali.

L’elevata entità della colonizzazione riscontrata dimostra con evidenza la capacita’ di resistenza alla barriera gastrica e fa ipotizzare che il Kluyveromyces fragilis marxianus B0399  possa essere efficacemente assunto anche a dosaggi sensibilmente più bassi di quelli esaminati (ad esempio 5- 10 milioni CFU/gg)

Al contrario si e’ osservato che nelle prove di alimentazione condotte su monogastrici di riferimento, come i mailetti (Bosi ⁹), i sovradosaggi (x 10 volte) hanno da luogo ad un leggero peggioramento dell'indice di conversione , (vedi dossier Kluyveroyces B0399 valutato dall’EFSA ed approvato dall Commissione CE (Bosi ⁹, Commission Regulation (EC) ¹⁷ ).

Per cui si ritiene probabilmente inefficace o addirittura inopportuno aumentare eccessivamente i dosaggi giornalieri (ad esempio oltre un logaritmo) a meno di prove specifiche .

 

Vale ancora osservare che, trattandosi di un probiotico a base di lieviti, il Kluyveromyces fragilis marxianus B0399 potrebbe essere assunto in concomitanza con farmaci antibiotici (Voughan ⁴)

Queste caratteristiche, unitamente alla mancanza di effetti collaterali stanno a connotare un profilo non solo di efficacia ma di comodità e sicurezza d’uso interessante, degno di ulteriori approfondimenti scientifici.

 

 

 

 

BIBLIOGRAFIA:

 

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-Susmel P., Stefanon B., Del Savio R., Boccalon S.
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