Trial#96: Candida albicans
Test in vitro sull’influenza del lievito lattico tipizzato (Kluyveromyces marxianus B0399) sullo sviluppo della Candida albicans ATCC10231.
Autori: dr.ssa Tiziana Cettolo, dr.ssa Lorena Riul- Laboratorio Specializzato di Microbiologia dell’ASA -CCIAA di Udine
Test in vitro sull’influenza del lievito lattico tipizzato (Kluyveromyces marxianus B0399) sullo sviluppo della Candida albicans ATCC10231
(Testo di sintesi)
Introduzione
Gli organismi probiotici sono definiti dalle linee guida della FAO/WHO (Cordoba, Argentina 2001) come microrganismi vivi che assunti in adeguate quantità creano effetti benefici nell’ospite.
Diversi studi sottolineano l’efficacia dei probiotici :
· nella modulazione del sistema immunitario (Matsuzaki T. 2000),
· nella prevenzione e nel trattamento di dismicrobismi intestinali che possono provocare fenomeni diarroici o sindromi causate da degenerazioni di reazioni infiammatorie (e.g. morbo di Crohn, sindrome da colon irritabile) (Castagliuolo M.S. et al., Gorbach S.L. 2000),
· nella riduzione dello sviluppo di fenomeni allergici come asma ed eczema nel bambino (Benn C. et al. 2002) se usati dalla madre in gravidanza,
· nella riduzione del rischio di infezioni nel tratto genito-urinario (Senok A.C. et al. 2005, Reid G. et al. 2003, Reid G. et al. 2004, Reid G. 2001).
I meccanismi d’azione sottesi a questi effetti sono molto vari e sono stati evidenziati da numerosi studi scientifici: competizione per gli spazi ed i nutrienti, attivazione del sistema immunitario dell’ospite e produzione di cataboliti antimicrobici (acidi grassi a catena breve ed in particolare acido lattico, perossido d’idrogeno,…).
E’ stato dimostrato inoltre che molti lieviti presentano una significativa attività di tipo killer parziale o totale contro miceti patogeni di importanza clinica (Sugisaki Y. et al. 1983, Walzer G.M. et al. 1995,Cerikcioglu N. 2003). Questa attività è stata attribuita alla produzione di tossine di tipo proteico.
In particolare è stata segnalata una possibile azione antimicotica di Kluyveromyces marxianus B0399, lievito omofermentante di origine alimentare umana utilizzato come probiotico in persone affette da disturbi intestinali riconducibili ad una disbiosi (meteorismo, stipsi alternata a diarrea, difficoltà di assimilazione, ecc.) e/o ad una intolleranza al lattosio. Il lievito infatti è produttore dell’enzima β galattosidasi.
A questo riguardo vi sono osservazioni (A. Miclavez 2006 comunicazione) che sembrano dimostrare anche un’attività positiva in vivo di K.marxianus B0399 su pazienti affette da candidosi. Nelle foto 1 e 2 si possono osservare le colonie di K. marxianus B0399 sui terreni usati per il test.
Sulla base di queste evidenze e dei risultati riportati in letteratura, lo studio condotto dall’equipe del Laboratorio Specializzato di Microbiologia dell’ASA -CCIAA di Udine si propone di valutare in vitro una possibile influenza di Kluyveromyces marxianus B0399 sullo sviluppo di Candida albicans ATCC10231.
Materiali e metodi
La prova è stata effettuata presso il Laboratorio Microbiologico della Azienda Speciale Ambiente della Camera di Commercio di Udine.
L’interazione dei lieviti è stata valutata allestendo alcuni test, in terreno agarizzato, per ciascuno dei quali viene data un’indicazione del metodo utilizzato e dei risultati ottenuti.
Il ceppo di K. marxianus oggetto di questi test è depositato, presso BCCM-Belgian Coordinated Collections of Microrganism, Culture Collection Mycoteque de l’Université Catholique de Louvain (Belgium) con sigla B0399 ed è stato fornito dai Laboratori Turval Italia Srl come pure la formula del terreno di coltura MV1 (lattosio 20 g, caseina idrolizzata 10 g, peptone 5 g, estratto di lievito 1 g, agar 15 g, acqua 1 l).
Il ceppo di lievito è stato conservato alla temperatura di 4° C. Al momento dell’uso è stato sub-culturato su terreno MV1 agarizzato ed incubato a 37° C per 24-48 ore.
Il ceppo di C. albicans ATCC 10231 acquistato presso Oxoid, rivitalizzato e mantenuto alla temperatura di 4° C in terreno idoneo.
Il medium su cui si sono effettuati i test è Chromalbicans agar (Biolife). La scelta è stata dettata dall’opportunità di distinguere su piastra le due specie di lievito. Candida ATCC 10231 appare colorata di blu grazie al cromogeno presente nel terreno, mentre K. Marxianus B0399 presenta colonie bianco latte.
Il pH (6.2) del terreno è mantenuto al valore indicato dall’azienda produttrice.
Le sospensioni sono state inoculate su piastre per spatolamento e non con metodica agar-germi: ciò per mimare al meglio le condizioni della mucosa vaginale.
Queste procedimenti e condizioni generali di trattamento e incubazione dei ceppi sono comuni a tutte le prove ove non specificato diversamente.
TEST A
Allestimento della prova:
Da una coltura over night su piastra, C. albicans ATCC 10231 è stata risospesa in soluzione fisiologica 0.85 % in una concentrazione di 1.25 x 105 ufc/ml. 100 µl della sospensione sono inoculati su una piastra di Chromalbicans agar per spatolamento e incubati a 37° C per 6 ore.
Al termine dell’incubazione sulla piastra sono depositati 50 µl del ceppo di K. marxianus B03998 inoculato in brodo MV1 24 ore prima.
La piastra è incubata a 37°C per 48 ore. La prova è effettuata in doppio.
Il conteggio delle UFC/ml della sospensione di K. marxianus B0399 al momento dell’inoculo è di 4.7 x 106.
Risultati e commento:
Nella zona dove è stata depositata la goccia di sospensione di K. Marxianus B0399 le colonie di C. albicans ATCC 10231 sono più piccole (foto A 1) rispetto alle colonie del lievito cresciute in assenza di K. Marxianus B0399: la morfologia dei due tipi di colonie è risultata identica, ma il diametro delle prime è inferiore rispetto a quello delle seconde.
TEST C
Allestimento della prova:
Una piastra di Chromalbicans agar è insemenzata per spatolamento con 100 µl di una sospensione in soluzione fisiologica (0.85% NaCl) di K. marxianus B0399 (7.4 x 105 ufc/ml) ed incubata a 37 °C per 18 ore.
Quindi sono stati versati e lasciati adsorbire 500 µl di una sospensione in soluzione fisiologia di C. albicans ATCC 10231 (2 x 104 ufc/ml).
La piastra è stata reincubata a 37° C per 48 ore.
Risultati e commento:
La crescita e lo sviluppo della Candida risulta alterato in presenza di K. Marxianus B0399. Le colonie di C. albicans ATCC 10231 risultano piccole come già osservato precedentemente (foto C 1)
TEST D
Allestimento della prova:
Il brodo MV1 è inoculato contemporaneamente con C. albicans ATCC10231e K. marxianus B0399 ed incubato a 37°C per 18 ore. Dopo l’incubazione una piastra di Chromalbicans agar è inoculata con 100 µl di sospensione microbica e incubata a 37°C per 48 ore.
Risultati e commento:
C. albicans ATCC 10231 si è sviluppata con notevole difficoltà con formazione di colonie più piccole rispetto al controllo. La foto D1 riporta lo sviluppo di C. albicans ATCC 10231 in presenza di K. marxianus B0399.
TEST E
Allestimento della prova
100 µl di brodo MV1 inoculato come nel test precedente sono stati immediatamente inoculati in una piastra di Chromalbicans agar. La piastra è stata incubata a 37°C per 48 ore.
Risultati e commento
Le colonie di C.albicans ATCC 10231 si sono sviluppate in modo ubiquitario ma con diametro ridotto (Foto E1).
Conclusioni:
L’insieme dei risultati delle diverse prove eseguite dimostra come in tutte le condizioni esaminate nel presente studio C. albicans ATCC 10231 cresciuta in presenza di K. marxianus B0399 presenti colonie di diametro inferiore rispetto a quelle cresciute in assenza di K. marxianus B0399.
Si è potuto evidenziare che K. marxianus B0399 ha la capacità di influenzare lo sviluppo delle colonie di C. albicans ATCC 10231 sia quando K. marxianus B0399 è inoculato preventivamente rispetto a Candida- test C) sia con azione di disturbo quando K. marxianus B0399 è inoculato a posteriori rispetto a Candida (test A).
FOTO:
Confronto foto A1-C1
A1: situazione in cui candida colonizza mucosa intestinale e ivi si sviluppa senza interferenze su terreno libero (colonie grandi, numerose e ben evidenziate sul terreno); poi arriva K. marxianus e le colonie di Candida regrediscono e diminuisce il loro diametro.
AZIONE CURATIVA
C1: situazione in cui il K. marxianus colonizza per primo la mucosa intestinale; poi sopraggiunge Candida ma il suo sviluppo è caratterizzato da colonie piccole e isolate tra loro.
ASSUNZIONE PREVENTIVA DI LIEVITO LATTICO
A1 C1
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Confronto A1-E1:
E1: situazione in cui i due lieviti arrivano alla mucosa intestinale nello stesso momento; chi ha la migliore adesività attecchisce più velocemente e si sviluppa sulla maggior superficie a scapito dell’altro lievito.
AZIONE PREVENTIVA
A1 E1
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Confronto foto A1-D1:
D1: situazione in cui i due lieviti arrivano simultaneamente sulla mucosa intestinale dopo contatto precedente : la candida non attecchisce sulla mucosa intestinale, colonie piccole e distanti tra loro.
18 ore di permanenza comune tra il Kluyveromyces marxianus B0399 e la Candida albicans portano ad una quasi totale inattivazione della capacità proliferativa di quest’ultima: come si può evidenziare nella foto sottostante, sul lato destro, le colonie di Candida reduci da un contatto DIRETTO con il Kluyveromyces B0399 si sviluppano con notevole difficoltà dovuta alla precedente azione esercitata dal lievito lattico.
AZIONE PREVENTIVA
A1 D1
Autori: dr.ssa Tiziana Cettolo, dr.ssa Lorena Riul- Laboratorio Specializzato di Microbiologia dell’ASA -CCIAA di Udine